簡(jiǎn)要描述:濾紙酶測(cè)試盒 濾紙酶(Filter paper Activity,F(xiàn)PA)試劑盒 上海牧榮生物科技有限公司專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品.為客戶(hù)全面解決實(shí)驗(yàn)、生產(chǎn)、開(kāi)發(fā)需求,提供方便、快捷的服務(wù)。
詳細(xì)介紹
品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
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應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),制藥 |
濾紙酶測(cè)試盒
微量法100T/48S
測(cè)定意義
纖維素酶是由微生物產(chǎn)生的多組分的酶系,能水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵生成葡萄糖,研究濾紙酶活力對(duì)纖維素酶的研究具有非常重要的意義。
測(cè)定原理
濾紙酶水解濾紙產(chǎn)生的還原糖能與3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色氨基化合物,在540nm處有最大光吸收,在一定范圍內(nèi)反應(yīng)液顏色深淺與還原糖的量成正比,可測(cè)定計(jì)算得濾紙酶的活力。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器
天平、研缽、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制
試劑一:液體25mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體40mL×1瓶,4℃保存。
濾紙條:50mg×50條。
酶液提取
組織:按照質(zhì)量(g):蒸餾水體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g,加入1mL蒸餾水)加入蒸餾水,冰浴勻漿后于4℃,12000rpm離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。
細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):蒸餾水體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后4℃,12000rpm離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。
培養(yǎng)液或其它液體:直接檢測(cè)。
測(cè)定操作
根據(jù)樣本數(shù)量取兩倍數(shù)量的濾紙條和Ep管,每支Ep管中放入一個(gè)卷狀濾紙條(注意要放入底部),作為底物。
對(duì)照管:取200μL滅活的酶液,加入500μL試劑一,充分混勻,再加入放有濾紙條的Ep管中,標(biāo)注為對(duì)照管。
測(cè)定管:取200μL酶液,加入500μL試劑一,充分混勻,再加入放有濾紙條的Ep管中,標(biāo)注為測(cè)定管。
對(duì)照管和測(cè)定管同時(shí)置于50℃水浴鍋中反應(yīng)30min。
加入800μL試劑二,沸水浴5min,自來(lái)水冷卻后取200μL于微量石英比色皿/96孔板中測(cè)定540nm處吸光值,分別記為A對(duì)照管和A測(cè)定管,△A= A測(cè)定管- A對(duì)照管。
酶活性計(jì)算公式
用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):y = 0.2805x - 0.0255,R2 = 0.9991
(1)按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
FPA(U/mg prot)=(△A+0.0255)÷ 0.2805×V反總÷(V樣×Cpr)÷T
= 0.891×(△A+0.0255)÷ Cpr
(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每克組織每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
FPA(U/g)=(△A+0.0255)÷ 0.2805×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 0.891×(△A+0.0255)÷ W
(3)按液體體積計(jì)算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
FPA(U/mL)=(△A+0.0255)÷ 0.2805×V反總÷V樣÷T
= 0.891×(△A+0.0255)
(4)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
FPA(U/104cell)=(△A+0.0255)÷ 0.2805×V反總÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量(萬(wàn)個(gè))÷V樣總)÷T
= 0.891×(△A+0.0255)÷ 細(xì)胞數(shù)量(萬(wàn)個(gè))
V反總:反應(yīng)總體積,1.5mL,V樣:反應(yīng)體系中加入樣本體積,0.2mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,30min
用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):y = 0.1403x - 0.0255,R2 = 0.9991
(1)按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
FPA(U/mg prot)=(△A+0.0255)÷ 0.1403×V反總÷(V樣×Cpr)÷T
=1.782×(△A+0.0255)÷ Cpr
(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每克組織每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
FPA(U/g)=(△A+0.0255)÷ 0.1403×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 1.782×(△A+0.0255)÷ W
(3)按液體體積計(jì)算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
FPA(U/mL)=(△A+0.0255)÷ 0.1403×V反總÷V樣÷T
= 1.782×(△A+0.0255)
(4)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
FPA(U/104cell)=(△A+0.0255)÷ 0.1403×V反總÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量(萬(wàn)個(gè))÷V樣總)÷T
= 1.782×(△A+0.0255)÷ 細(xì)胞數(shù)量(萬(wàn)個(gè))
V反總:反應(yīng)總體積,1.5mL,V樣:反應(yīng)體系中加入樣本體積,0.2mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,30min
注意事項(xiàng)
用干凈的鑷子取出濾紙條,帶手套卷成卷放入Ep管底部。
樣本滅活時(shí)保證同一批樣本處理時(shí)間一致,建議沸水浴十分鐘。
批量樣本測(cè)定之前先做1-2個(gè)樣本的預(yù)實(shí)驗(yàn),若吸光值超過(guò)1.2,建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
顯色后取檢測(cè)液時(shí)注意槍頭不要碰到濾紙條,以免帶入毛狀物,影響測(cè)定結(jié)果。
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