詳細介紹
品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 現貨 |
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應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業,農業,制藥 |
β葡萄糖苷酶(βGC)/纖維二糖酶測試盒
正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
β-GC(EC 3.2.1.21)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,催化β-糖苷鍵水解,具有多方面生理作用:在纖維素的糖化作用中,β-GC負責進一步水解纖維素二糖和纖維素寡糖生成葡萄糖;β-GC水解萜烯類香氣前驅體,使糖苷鍵合態變成游離態。從而產生香味;β-GC能夠水解植物體內野黑櫻苷,釋放HCN,從而防止昆蟲取食。
測定原理:
β-GC分解對-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通過測定吸光值升高速率來計算β-GC活性。
自備用品:
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前每瓶加入12mL蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑仍-20℃保存。
試劑二:液體15mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體15mL×1瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1、細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);15000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
3、培養液、血清(漿)等液體樣本:直接檢測。
測定步驟
分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至400nm,蒸餾水調零。
加樣表
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
試劑一 | 120 | |
蒸餾水 | 120 | |
試劑二 | 150 | 150 |
樣本 | 30 | 30 |
充分混勻,放入37℃準確水浴30min后,立即放入95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失),流水冷卻后充分混勻(以保證濃度不變),8000g,4℃,離心5min,取上清液(在EP管或96孔板中加入下列試劑)
上清液 | 70 | 70 |
試劑三 | 130 | 130 |
充分混勻,室溫靜置2min后, 400nm處測定吸光值A,計算ΔA=A測定管-A對照管。
每個測定管需設一個對照管。
β-GC活力計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準條件下測定的回歸方程為y = 0.00585x -0.0027;x為標準品濃度(nmol/mL),y為吸光值。
(1)按液體體積計算:
單位的定義:每mL樣本每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
β-GC活性(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷V樣÷T
=56.98×(ΔA+0.0027)
(2)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
β-GC活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T
=56.98×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
(3)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
β-GC活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=56.98×(ΔA+0.0027) ÷W
(4)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
β-GC活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T
=0.114×(ΔA +0.0027)
V反總:反應體系總體積,0.3mL;V樣:加入反應體系中樣本體積,0.03mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g; 500:細胞或細菌總數,500萬;T:反應時間,30min。
b.用96孔板測定的計算公式如下
標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0039x -0.0027;x為標準品濃度(nmol/mL),y為吸光值。
(1)按液體體積計算:
單位的定義:每mL樣本每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
β-GC活性(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反總]÷V樣÷T
=85.47×(ΔA+0.0027)
(2)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
β-GC活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T
=85.47×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
(3)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
β-GC活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=85.47×(ΔA+0.0027) ÷W
(4)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
β-GC活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T
=0.171×(ΔA +0.0027)
V反總:反應體系總體積,0.3mL;V樣:加入反應體系中樣本體積,0.03mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g; 500:細胞或細菌總數,500萬;T:反應時間,30min。
上海牧榮生物科技有限公司
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