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品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 現貨 |
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應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業,農業,制藥 |
γ谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCL)測試盒
注意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
GCL 是 GSH 合成的限速酶,GSH 對 GCL 有反饋抑制作用。GCL基因表達受多種因素調節,如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性高低對GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。
測定原理:
在ATP和Mg2+存在下,GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸;同時ATP去磷酸化產生無機磷分子,通過測定無機磷增加速率,即可計算出GCL活性。
自備儀器和用品:
冷凍離心機、水浴鍋、移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、濃硫酸和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體105mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加6 mL蒸餾水充分震蕩溶解。
試劑三:粉劑×1管,4℃保存。臨用前加入蒸餾水1.5 mL充分震蕩溶解。
試劑四:液體7mL×1瓶,室溫保存。
試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入12 mL蒸餾水,充分震蕩溶解后,緩緩加入400µL濃硫酸(自備),邊加邊攪拌。
粗酶液提取:
組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
血清等液體:直接測定。
GCL測定操作:
分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長到660nm,蒸餾水調零。
空白管:取1.5mLEp管,依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和蒸餾水24µL,混勻后蓋緊,37℃水浴準確反應15 min;再加入試劑四60µL,混勻后,室溫(25℃左右)8000g,離心10 min,取上清100µL,加入試劑五100µL,混勻后蓋緊,45℃水浴10min,冷卻后測定660nm處光吸收,記為A空白管。
測定管:取1.5mLEp管,依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和上清液24µL,混勻后蓋緊,37℃水浴準確反應15 min;再加入試劑四60µL,混勻后,室溫(25℃左右)8000g,離心10 min,取上清100µL,加入試劑五100µL,混勻后蓋緊,45℃水浴10min,冷卻后測定660nm處光吸收,記為A測定管。
注意:空白管只需要測定一次。
GCL活性計算公式:
標準曲線:y=0.1427x,R2=0.9987
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義:37℃下,每毫克蛋白每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL(μg/min /mg prot)=[(A測定管-A空白管)÷0.1427×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T
=3.815×(A測定管-A空白管)÷Cpr
(2)按樣本質量計算
活性單位定義:37℃下,每克組織每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為為1個酶活單位。
GCL(μg/min /g 鮮重)= [(A測定管-A空白管)÷0.1427×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 3.815×(A測定管-A空白管)÷W
(3)按細胞數量計算
活性單位定義:37℃下,每104個細胞每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL(μg/min /104 cell)=[(A測定管-A空白管)÷ 0.1427×V反總]÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T
= 3.815×(A測定管-A空白管)÷細胞數量
(4)按照液體體積計算
活性單位定義:37℃下,每毫升液體每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL(μg/min /mL)= [(A測定管-A空白管)÷ 0.1427×V反總]÷V樣÷T
= 3.815×(A測定管-A空白管)
0.1427:回歸方程系數;V反總:反應總體積(mL)196 µL=0.196 mL;Cpr:上清液蛋白質濃度,mg/mL; V樣:加入反應體系中上清液體積,24µL =2.4×10-2 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;W:樣本質量,g;T:反應時間:15min。
b. 使用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線:y=0.07135x,R2=0.9987
((1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義:37℃下,每毫克蛋白每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL(μg/min /mg prot)= [(A測定管-A空白管)÷0.07135×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T
=7.63×(A測定管-A空白管)÷Cpr
(2)按樣本質量計算
活性單位定義:37℃下,每克組織每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為為1個酶活單位。
GCL(μg/min /g 鮮重)= [(A測定管-A空白管)÷0.07135×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 7.63×(A測定管-A空白管)÷W
(3)按細胞數量計算
活性單位定義:37℃下,每104個細胞每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL(μg/min /104 cell)=[(A測定管-A空白管)÷0.07135×V反總]÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T
= 7.63×(A測定管-A空白管)÷細胞數量
(4)按照液體體積計算
活性單位定義:37℃下,每毫升液體每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL(μg/min /mL)= [(A測定管-A空白管)÷0.07135×V反總]÷V樣÷T
=7.63×(A測定管-A空白管)
0.07135:回歸方程系數;V反總:反應總體積(mL)196 µL=0.196 mL;Cpr:上清液蛋白質濃度,mg/mL; V樣:加入反應體系中上清液體積,24µL =2.4×10-2 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應時間:15min。
注意事項:
(1)樣品處理等過程均需要在冰上進行,且須在當日測定酶活力,以免影響其活力。如果是勻漿液,避免反復凍融。
(2)所有試劑配制完后,除表明4℃保存外,請于1天內用完。
(3)實驗過程請帶手套,試劑三中有強腐蝕性物質,注意不要濺到皮膚上或眼睛內。
(4)測定吸光值時請于水浴后10~40分鐘內測完。
(5)樣本測定前先取1-2個樣做預實驗,如吸光值太高,應先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當倍數,使得吸光值在標準曲線范圍內,哺乳動物組織和血液一般稀釋3~5倍。
(6)試劑三配制過程中,可能會產生黑色固體,其不影響結果,注意吸取時不要將黑色固體吸入。
(7)細胞中GCL活性測定時,細胞數目須在300萬-500萬之間,細胞中GCL的提取時可加試劑一(或生理鹽水)后研磨或超聲波處理,不能用細胞裂解液處理細胞;
上海牧榮生物科技有限公司
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