TGIRT™-III Enzyme，

TGIRT™-III Enzyme，描述：

1. 全面的鏈特異性轉錄組分析。

TGIRT®-seq 的 ribodepleted、碎片化的通用人類參考 RNA 樣本概括了人類轉錄本和 spike-ins 的相對豐度，與非鏈特異性 TruSeq v2 相比，優(yōu)于鏈特異性 Tru-Seq v3。TGIRT®-seq 比 TruSeq v3 具有更高的鏈特異性，并消除了 TruSeq 固有的隨機六聚體引發(fā)的采樣偏差。TGIRT®-seq 顯示出比 TruSeq 更均勻的 5' 到 3' 基因覆蓋率并識別出更多的剪接點。TGIRT®-seq 支持在與結構化小 ncRNA（包括 tRNA）相同的 RNA-seq 中同時分析 mRNA 和 lncRNA，而 tRNA 基本上不存在于 TruSeq 數(shù)據(jù)集中。^8個

2. 全細胞、外泌體、血漿和其他細胞外 RNA 的 RNA-seq。

快速處理時間（通過 PCR 步驟構建 RNA-seq 文庫<5 小時）；需要少量 RNA（低 ng 范圍）；全面的轉錄本概況，包括 mRNA 和 lncRNA 以及小 ncRNA，包括 tRNA、pre-miRNA 和其他結構化小 ncRNA 的全長讀數(shù)；與傳統(tǒng)方法相比，偏差更小，鏈特異性更高。^7,8,15

3. 在 RIP-seq、HITS-CLIP、irCLIP、CRAC、核糖體分析等方法中通過 TGIRT® 模板轉換構建 RNA-seq 文庫。

快速處理時間（通過 PCR 步驟構建 RNA-seq 文庫 < 5 小時）；需要少量 RNA（低 ng 范圍）；不需要 RNA 連接酶，通過減少程序中的步驟來減少偏差和提高效率。^1,10,11

4. 比逆轉錄病毒 RT 具有更高的熱穩(wěn)定性、持續(xù)合成能力和鏈置換活性。

• 使用錨定寡核苷酸 (dT) 引物構建聚腺苷酸化 RNA 的 RNA-seq 文庫，與沒有核糖核酸去除步驟的逆轉錄病毒 RT 相比，其 5' 至 3' 覆蓋范圍更均勻。^1個

• 通過基于毛細管電泳的方法（如 SHAPE 或 DMS 結構映射）實現(xiàn) RNA 結構映射，與逆轉錄病毒 RT 相比，讀取長度明顯更長，過早停止更少。^1,16

• 能夠分析包含富含 GC 的重復擴增的 RNA 模板。¹⁸

• 能夠從 tRNA 和其他小的結構化/修飾的 ncRNA 合成全長、端到端的 cDNA，這些 ncRNA 對逆轉錄病毒 RT 具有抵抗力。^4-9,12-15    
  

5. 人血漿和大腸桿菌 基因組DNA 的 ssDNA-seq。

通過直接在 DNA 鏈的 3' 端啟動 DNA 合成，同時連接 DNA-seq 適配器，無需末端修復、加尾或連接，以更簡單的工作流程捕獲精確的 DNA 末端。能夠分析核小體定位、轉錄因子結合位點、DNA 甲基化位點和組織來源。

酶的建議用途：

1. 全面的鏈特異性轉錄組分析。^8個

2. 全細胞、外泌體、血漿和其他無細胞 RNA 的 RNA-seq。^7,8,15

3. miRNA、tRNA 和其他小的非編碼 RNA 的分析。^1-9,12,15

4. RIP-seq、HITS-CLIP、irCLIP 和 CRAC，用于表征 RNA-蛋白質相互作用和核糖體分析。^1,10,11

5. 通過高通量測序鑒定 RNA 堿基修飾。^4,5,13,14

6. 使用 SHAPE 和 DMS 修飾等方法進行全基因組或靶向 RNA 結構作圖。^1,16

7. 富含 GC 的重復擴增的逆轉錄和定量。¹⁸

8. 長 cDNA 的合成。^1個

9. RT-qPCR。^1個

10. 單鏈 DNA 序列。¹⁷

11. FFPE 腫瘤樣本分析（咨詢 InGex 技術支持）。

酶特性和新活性：

• 比逆轉錄病毒逆轉錄酶具有更高的熱穩(wěn)定性、持續(xù)合成能力和保真度，允許從高度結構化或大量修飾的 RNA（例如tRNA）和包含富含 GC 的重復擴增的 RNA 合成全長、端到端的 cDNA。^1-9,12,15,18

• 新型端到端模板轉換活動，可在逆轉錄過程中連接 RNA-seq 或 PCR 接頭，無需單獨的 RNA 3'-接頭連接步驟。¹這種模板轉換活動極大地促進了鏈特異性 RNA-seq 文庫的構建，與使用隨機六聚體引物或使用 RNA 連接酶進行接頭連接的程序相比，偏差更小。^1,7,8

• 從退火引物高效合成 cDNA。退火引物的預計 Tm_應>60 ^o C。建議在室溫下將酶與底物在反應混合物中預孵育 30 分鐘，然后通過添加 dNTP 啟動反應。應通過測試 25 至 450 mM NaCl 的一系列鹽濃度來確定新應用的最佳條件。

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