簡要描述:RNA-simple isolation Reagent 廣泛適用于從各類動物組織、植物材料、培養(yǎng)細胞、細菌等 樣品中提取 Total RNA 和Small RNA。
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品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 一個月 |
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應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),綜合 |
RNA-simple isolation Reagent
適用范圍:常規(guī)動物組織(如:肝臟、心臟、腎臟、腦組織、骨骼肌等,不包括脾臟和肺臟)、植物組織(如水稻、玉米、擬南芥、煙草、小麥、大豆等,不包括棉花)、各類細胞系均具有很好的提取效果。保存條件:2-8℃提取試劑操作流程:
廣泛適用于從各類動物組織、植物材料、培養(yǎng)細胞、細菌等 樣品中提取 Total RNA 和Small RNA。與傳統(tǒng) Trizol 一樣屬于通用型 Total RNA 提取試劑,與 傳統(tǒng) Trizol 提取方法相比,本產(chǎn)品使用方法簡單,不需要使用氯仿進行分層,且全程可在常溫 進行;此外,本產(chǎn)品在高效地抑制 RNA 酶(Rnase)活性的同時,將蛋白質(zhì)、DNA、多糖等雜 質(zhì)沉淀到管底,從而實現(xiàn)單相提取,并有力保證了 RNA的完整度和純度。使用本產(chǎn)品在 50min 內(nèi)即可完成全部的提取過程,提取的 RNA 可以直接用于 cDNA 克隆、qRT-PCR 檢測、mRNA 純化、體外翻譯、Northern blotting雜交、高通量測序等各種分子生物學實驗。
使用方法1.樣本處理1) 動物/植物組織① 將新鮮組織經(jīng)液氮速凍后,迅速轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的研缽中,用研杵研磨,期間不斷加入液氮,直至研磨成粉末狀(無明顯可見顆粒)。▲研磨不全會影響 RNA 的得率和質(zhì)量。② 將研磨成粉的樣品轉(zhuǎn)移至離心管中,大約每25mg組織加入500ul本試劑,劇烈振蕩或移液槍吹打,使樣品充分裂解。▲ 每500ul本試劑最多可以裂解50mg常規(guī)組織,過多的樣本量可能會導致裂解不充分,并使產(chǎn)物純度降低?!糠猪g性強或含較多外基質(zhì)的組織,可能會出現(xiàn)不能全溶解的現(xiàn)象,在下一步操作RNA 提取的步驟 2)中將進入沉淀中,不會影響后續(xù) RNA 提取及 RNA 質(zhì)量?!?若沒有條件用液氮研磨,可將新鮮組織盡量剪碎浸泡在本試劑中,用電動勻漿器高速勻漿至組織塊全裂解。2) 懸浮細胞① 離心收集細胞,將獲得的細胞沉淀用1×PBS重懸,再次離心,棄盡上清。② 加入本試劑,每1 - 5×106個細胞加入500ul本試劑。③ 用移液器反復(fù)吹打直至充分裂解。3) 貼壁細胞① 棄去細胞培養(yǎng)液,用1×PBS清洗一次。② 通常,每10cm直徑的細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細胞加入2-3ml本試劑,常規(guī)六孔板(孔直徑3.5cm)每孔加500ul本試劑,使之充分覆蓋到細胞表面,然后用移液器將細胞吹打下來?!鴮τ谫N壁牢固的細胞(細胞團)可采用細胞刮或潔凈的槍頭剝離,亦可在加入本試劑之前采用胰酶將細胞消化下來,然后按照懸浮細胞處理。③ 將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中,用移液器反復(fù)吹打直至充分裂解。2.RNA提取1) 向上述裂解液中加入2/5體積的Rnase-free Water(每500ul本試劑使用200ul),上下顛倒混勻,室溫靜置5min。2) 12,000×g 室溫離心15min。3) 取出離心管,此時溶液分成上層水相(含RNA)和深色的下層沉淀(含蛋白質(zhì)、DNA、多糖等雜質(zhì)),小心吸取上層水相至一個新的離心管中?!蠈铀嗟捏w積約占總體積的 90%,如用 500ul 本試劑進行提取,上層水相約為 640ul,建議吸取 500ul;針對微量的樣本進行提取時,為減少 RNA 損失,可以全部轉(zhuǎn)移上清?!敇颖镜耐度氲陀谕扑]量時,離心后可能不會出現(xiàn)下層沉淀,屬于正?,F(xiàn)象,可繼續(xù)按后續(xù)步驟完成提取。4) 加入等體積異丙醇,上下顛倒混勻,室溫靜置10min。5) 12,000×g 室溫離心10min,通??梢钥匆姲咨恋?,小心棄去上清。▲部分組織材料由于含有較多的代謝產(chǎn)物,導致沉淀不能聚集而分散在離心管壁上,此時,請沿液面緩慢吸取上清。6) 加入500ul 75%乙醇(Rnase-free Water配制),輕彈管底讓沉淀懸浮起來,并上下顛倒數(shù)次。7) 8,000×g 室溫離心3min,棄去上清。8) 重復(fù)步驟6和7一遍,棄盡上清?!鵀闇p少雜質(zhì)殘留,應(yīng)盡可能的將上清棄干凈。建議棄去大部分上清后,短暫離心將殘留液體甩至管底,再用移液器將剩余液體全部吸掉。9) 室溫放置晾干,加入適量的Rnase-free Water溶解沉淀,室溫渦旋3min(或使用移液器反復(fù)吹打),使RNA沉淀充分溶解。提取的RNA產(chǎn)物可以分裝后在-85~-65℃長期保存,在-30~ -15℃僅可短期保存?!鳵NA 沉淀晾干 2-3min 即可,不要過度晾干,RNA 全干燥后會很難溶解。▲RNA 產(chǎn)物需要充分溶解,否則可能導致濃度定量失準以及 OD260/OD280 比值偏低。3.產(chǎn)物檢測1) 產(chǎn)物純度可用分光光度計檢測,OD260/OD280比值在1.8-2.2之間表明RNA純度較高。2) 產(chǎn)物濃度可以采用分光光度計檢測,RNA濃度(ng/ul)=OD260×稀釋倍數(shù)×40;或者采用Qubit直接檢測。3) 取0.5- 1ug RNA,用1×TE或Rnase-free Water稀釋至8ul,再加入1ul 10×DNA loading buffer,混勻,進行1%瓊脂糖凝膠電泳;或采用2100檢測,測定RNA產(chǎn)物的RIN值。
常見問題及解決方案
1.RNA發(fā)生降解RNA降解可能發(fā)生在多個環(huán)節(jié),實驗過程中需要注意以下事項:① 確保提取RNA的試劑和器具沒有被Rnase污染,所有離心管、槍頭及相關(guān)溶液都必須無Rnase污染,耐高溫器物可于150℃烘烤4-6h以去除Rnase,其它器物可用0.1%DEPC水浸泡過夜;② 做好防護工作,戴口罩和一次性干凈手套,并在單獨的潔凈區(qū)操作;③ 細胞或組織樣品需立即加入本試劑,并迅速進行勻漿裂解。若處理不當,發(fā)生細胞或組織凍融,Rnase會被釋放出來降解RNA。針對內(nèi)源Rnase含量高或不易勻漿的組織,需將組織切成小塊后立即投入液氮冷凍,然后進行研磨,在整個研磨過程中,樣品不得融化;④ 提取的RNA樣品需要妥善保存,建議取少量進行檢測,其余樣品分裝于-85~-65℃保存。進行電泳檢測可以提高電壓并縮短跑膠時間,同時對電泳緩沖液進行冰浴降溫,防止跑膠過程中RNA發(fā)生降解。2.出現(xiàn)污染① 蛋白質(zhì)污染:采用分光光度計檢測提取產(chǎn)物OD260/OD280偏低時,提示可能存在蛋白質(zhì)污染。遇到此種情況,需要考是否組織投入量過大,導致裂解不充分,可以適當增加本試劑或者降低組織投入量進行提取;② 多糖污染:采用分光光度計檢測提取產(chǎn)物OD260/OD230偏低時,提示可能存在多糖污染,需要考慮是否是因為乙醇未去除干凈或者是組織投入量過大導致,此時,可以在RNA提取步驟9時適當延長RNA晾干時間或適當降低組織投入量進行提取操作;③ 脂肪污染:處理脂肪含量豐富的組織時,經(jīng)過RNA提取步驟2之后,上層是大量脂肪,可以轉(zhuǎn)移澄清的中間層進行下一步操作。3.加入異丙醇離心后看不見沉淀通常情況下,經(jīng)過異丙醇沉淀可以看見白色沉淀。若遇到沉淀不可見的情況,可能是RNA含量低或者組織投入量過低,建議加入異丙醇(RNA提取步驟4)后在2~8℃或-30~-15℃放置10-30min后再離心;且在RNA提取步驟5進行棄上清操作時,請采用吸取而不是傾倒的方法,以免沉淀丟失。此外,部分組織材料由于含有較多的代謝產(chǎn)物,導致沉淀不能聚集而分散在離心管壁上,此時,請沿液面緩慢吸取上清。4.如何保存組織樣本如果不能立刻提取 RNA,應(yīng)將組織離體后迅速投入液氮冷凍,并用液氮保存;或液氮速凍后,轉(zhuǎn)移至-85~-65℃保存。不能直接將新鮮組織放在-85~-65℃冷凍,因為樣品的凍結(jié)是一個緩慢的過程,在這個過程中內(nèi)源 Rnase 會將 RNA 降解。
本產(chǎn)品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途
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