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品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 現貨 |
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應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業,農業,制藥 |
線粒體蘋果酸脫氫酶(MDHm)測試盒
微量法 100管/96樣
正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
MDH (EC 1.1.1.37)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,線粒體中MDH是TCA循環的關鍵酶之一,催化蘋果酸形成草酰乙酸;相反,胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產物, 連接多條重要的代謝途徑。因此,MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色,包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統、活性氧代謝和抗病性等。根據不同的輔酶特異性,MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH,細菌中通常只含有NAD-MDH,在真核細胞中,NAD-MDH分布于細胞質和線粒體中。
測定原理:
MDHm催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸,導致340nm處光吸收下降。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:100mL×1瓶,-20℃保存;
試劑二:20mL×1瓶,-20℃保存;
試劑三:1.5mL×1支,-20℃保存;
試劑四、液體20 mL×1瓶,在4℃保存;
試劑五、粉劑×1瓶,-20℃保存;
樣本測定的準備:
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
將勻漿液于600g,4℃離心5min。
棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的MDH(此步可選做)。
在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復30次),用于MDHm活性測定。
測定步驟:
分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。
2、檢測工作液的配制:用時在試劑五中加入19mL試劑四和0.5mL蒸餾水,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
3、測定前將檢測工作液在37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min以上。
4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL樣本和195μL工作液,混勻后立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。
MDHm活力單位的計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
MDHm(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
MDHm(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T =1299×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
MDHm(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(2000×V樣÷V樣總)÷T=0.65×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.005 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202mL;T:反應時間,1 min;W:樣本質量,g;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;2000:細胞或細菌總數,2000萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
MDHm(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
MDHm(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T =2598×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
MDHm(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(2000×V樣÷V樣總)÷T=1.3×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.005 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,1 min;W:樣本質量,g;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;2000:細胞或細菌總數,2000萬。
上海牧榮生物科技有限公司
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