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品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 現貨 |
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應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業,農業,制藥 |
乳酸脫氫酶(LDH)測試盒
正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
LDH(EC 1.1.1.27)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,是糖酵解途徑的末端酶,催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應,伴隨著NAD+/NADH之間互變。
測定原理:
LDH催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸進一步與2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙,在堿性溶液中顯棕紅色,顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:60mL×1瓶, 4℃保存;
試劑一:液體5 mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:粉劑×1支,-20℃保存,用時加入10μL試劑五和1.3 mL蒸餾水充分溶解備用,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;
試劑三:液體5 mL×1瓶,4℃保存;
試劑四:液體20 mL×1瓶,4℃保存;
試劑五:液體100μL×1支,4℃保存;
樣品測定的準備:
1、細菌、細胞或組織樣品的制備:
細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為1000~5000:1的比例(建議2000萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至450nm,蒸餾水調零。
2、樣本測定(在EP管中加入下列試劑)
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 10 | 10 |
試劑一 | 50 | 50 |
試劑二 | 10 | |
蒸餾水 | 10 |
充分混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)準確水浴15min
試劑三 | 50 | 50 |
充分混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)準確水浴15min
試劑四 | 150 | 150 |
充分混勻,室溫靜置15min, 450 nm下測定吸光度,計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管需要設一個對照管。
LDH活力單位的計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、標準條件下測定的回歸曲線, y = 0.9108x+0.0037 (x為標準品濃度,umol/mL;y為ΔA)。
2、血清(漿)LDH活力的計算
單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/mL)=(ΔA-0.0037)÷0.9108÷T×103=73.2×ΔA
3、細胞、細菌和組織中LDH活力的計算
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0037)÷0.9108×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =73.2×ΔA÷Cpr
需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒。
(2) 按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA-0.0037)÷0.9108×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =73.2×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/104 cell)= [(ΔA-0.0037)÷0.9108×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.037×ΔA
V1:加入反應體系中樣本體積,0.01mL;V2:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,15 min;Cpr:蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;2000:細胞或細菌總數,2000萬;103:1umol/mL=103 nmol/mL。
b.使用96孔板測定的計算公式如下:
1、標準條件下測定的回歸曲線, y = 0.4554x+0.0037 (x為標準品濃度,umol/mL;y為ΔA)。
2、血清(漿)LDH活力的計算
單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/mL)=(ΔA-0.0037)÷0.4554÷T×103=146.4×(ΔA-0.0037)
3、細胞、細菌和組織中LDH活力的計算
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0037)÷0.4554×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =146.4×(ΔA-0.0037)÷Cpr
需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒。
(2) 按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA-0.0037)÷0.4554×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =146.4×(ΔA-0.0037)÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/104 cell)= [(ΔA-0.0037)÷0.4554×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.073×(ΔA-0.0037)
V1:加入反應體系中樣本體積,0.01mL;V2:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,15 min;Cpr:蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;2000:細胞或細菌總數,2000萬;103:1umol/mL=103 nmol/mL。
標準曲線線性范圍為:0.1 umol/mL -2 umol/mL。
ΔA線性范圍為:0.01 -1。
上海牧榮生物科技有限公司
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