詳細介紹
品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 現貨 |
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應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業,農業,制藥 |
αL阿拉伯呋喃糖苷酶(αLAf)測試盒(比色法)
正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
α-L-Af 是一種能夠水解非還原呋喃阿拉伯糖殘基的糖苷酶類,使細胞壁阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖等中性糖不斷解離,促進果膠的增溶和降解。由于果實成熟過程中常常伴隨著阿拉伯糖的喪失,該酶活性在果實成熟軟化中的研究具有重大意義。
測定原理:
α-L-Af分解對硝基酚阿拉伯呋喃糖苷生成對-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通過測定吸光值升高速率來計算α-L-Af活性。
自備用品:
酶標儀/可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入2.5mL蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑仍-20℃保存。
試劑二:液體4mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體13mL×1瓶,4℃保存。
粗酶液提?。?/p>
1、細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);15000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟:
分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至400nm,蒸餾水調零。
2、樣本測定(在EP管或96孔板中依次加入下列試劑):
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
試劑一 | 25 | |
蒸餾水 | 25 | |
試劑二 | 35 | 35 |
樣本 | 10 | 10 |
迅速混勻,放入37℃保溫30min
試劑三 | 130 | 130 |
充分混勻, 400nm處測定吸光值A,計算ΔA=A測定-A對照。每個測定管需設一個對照管。
α-L-Af活性計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準條件下測定的回歸方程為y =0.00585x -0.0027;x為標準品濃度(nmol/mL),y為吸光值。
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每min產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
α-L-Af活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T
=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每小時產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
α-L-Af活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每小時產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
α-L-Af活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T
=0.08×(ΔA +0.0027)
Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;V反總:反應體系總體積,0.07mL;V樣:加入反應體系中樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣本質量,g; 500:細胞或細菌總數,500萬;T:反應時間,30min。
b.用96孔板測定的計算公式如下
標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0039x -0.0027;x為標準品濃度(nmol/mL),y為吸光值。
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每小時產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
α-L-Af活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T
=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每小時產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
α-L-Af活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每小時產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
α-L-Af活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T
=0.12×(ΔA +0.0027)
Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;V反總:反應體系總體積,0.07mL;V樣:加入反應體系中樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣本質量,g; 500:細胞或細菌總數,500萬;T:反應時間,30min。
上海牧榮生物科技有限公司
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