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品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 現貨 |
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應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業,農業,制藥 |
NADP-蘋果酸酶(Malic enzyme,NADP-ME)試劑盒
正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
ME廣泛存在于微生物、培養細胞、動物和植物胞漿中,尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應,產生丙酮酸和CO2,以及伴隨NAD(P)+的還原反應,是蘋果酸代謝的關鍵酶。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關。近年來植物ME活性測定較多,已經成為抗氧化研究的熱點。根據輔酶專一性和對底物特異性的不同,可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
測定原理:
NADP-ME催化NADP+還原成NADPH,在340nm下測定NADPH增加速率。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存。;
試劑一:液體30mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存; 臨用前加入20mL試劑一充分振蕩,溶解待用,用不完的試劑分裝后-20度保存,禁止反復凍融。
試劑三:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入2.5mL蒸餾水充分振蕩,溶解待用,用不完的試劑分裝后-20度保存,禁止反復凍融。
樣本的前處理:
1、細菌、細胞或組織樣品的制備:
細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);14000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。14000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。
2、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和170μL試劑二,混勻,30℃孵育5min,加入20μL試劑三,混勻后立即記錄340nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。
NADP-ME活性計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-ME(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-ME(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T = 3215×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-ME(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T =6.43×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-ME(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣) ÷T= 6431×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-ME(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T = 6431×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-ME(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T =12.86×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol/cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。
上海牧榮生物科技有限公司
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