純化是大多數分子生物學實驗中的常見程序,例如去除 PCR 反應中的短引物、未摻入的 dNTP、酶和鹽以及其他雜質。純化方法有多種,包括過濾、離心和分離。分離已成為生命科學中非常流行的方法,并使用各種類型的固相支持物。這包括瓊脂糖珠、瓊脂糖珠、二氧化硅珠和磁珠。使用磁珠分離是所有磁珠分離方法中最快、最干凈且有效的技術。
磁珠可以涂有針對抗原、抗體、蛋白質或核酸的特異性親和配體。將磁珠與樣品一起孵育后,對磁珠(和附著的生物分子)施加磁力,以將磁珠收集成濃縮顆粒。分離完成后,可以輕松去除上清液,并且可以從磁珠上洗脫與珠子結合的生物分子。
使用磁力操縱磁珠的能力使得洗滌步驟比使用瓊脂糖、瓊脂糖凝膠或硅珠更容易和更快。純化的產物還可以使用磁力分離方法以更濃縮的形式回收。
以下是給新用戶的一些提示:
1. 重懸珠子
磁珠需要有足夠的磁性含量,以便可以通過磁鐵簡單地下拉。傳統磁珠的尺寸超過 1 µm (1 µm = 1000nm)。較新的珠子尺寸更小(低至數百納米),以增加珠子表面積。這導致結合能力增加并改善分散性。磁珠是由氧化鐵組成的重顆粒,因此它們會隨著時間的推移而沉淀。珠子的尺寸越大,沉淀得越快。使用前渦旋并重懸磁珠非常重要,以重新分散磁珠并確保等分試樣之間的一致性。
2. 清洗珠子
增加洗滌步驟的數量有助于減少與磁珠的非特異性結合。用乙醇(用于核酸純化)或洗滌緩沖液洗滌磁珠時,請使用足夠的洗滌溶液覆蓋沉淀。
3. 了解珠子的特性
磁珠有不同的尺寸、形狀、磁響應、涂層、緩沖條件和附著的官能團。這些變量影響珠子的特性。獲取珠子的基本信息對于更好地了解如何處理它們非常重要。
4. 捕獲珠子
一般來說,磁珠會被磁鐵吸引并在一分鐘內形成顆粒。延長磁珠對磁鐵的吸引力,以確保所有磁珠均被回收。
5. 去除洗滌液時不要擾動珠粒
去除洗滌液或上清液時,傾斜移液器吸頭,使吸頭不接觸磁珠沉淀。這可以防止珠子與上清液重新混合。使用具有傾斜側面的磁力架,使珠粒集中在管壁的一側。這使得去除上清液變得更加容易。