用 途:用于人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中白細(xì)胞介素 10(IL-10)測(cè)定。
工作原理
本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA) 測(cè)定樣品中 人白細(xì)胞介素 10(IL-10)水平。向預(yù)先包被了白細(xì)胞介素 10(IL-10)單克隆抗體 的酶標(biāo)孔中加入白細(xì)胞介素 10(IL-10),溫育;溫育后,加入生物素標(biāo)記的抗 IL-10 抗體。再與鏈霉親和素-HRP 結(jié)合,形成免疫復(fù)合物,再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌, 去除未結(jié)合的酶,然后加入底物 A、B,產(chǎn)生藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終 的黃色。顏色的深淺與樣品中白細(xì)胞介素 10(IL-10)的濃度呈正相關(guān)。
試劑盒組成
試劑盒組成 | 48 孔配置 | 96 孔配置 | 保存 |
說(shuō)明書 | 1 份 | 1 份 | |
封板膜 | 2 片 (48) | 2 片 (96) | |
密封袋 | 1 個(gè) | 1 個(gè) | |
酶標(biāo)包被板 | 1 ×48 | 1 ×96 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 400 ng/L | 0.5ml×1 瓶 | 0.5ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 3ml×1 瓶 | 6ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
鏈霉親和素-HRP | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
生物素標(biāo)記的抗 IL-10 抗體 | 0.5ml×1 瓶 | 1 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑 A 液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑 B 液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
終止液 | 3ml×1 瓶 | 6ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
濃縮洗滌液 | (20ml×20 倍) × 1 瓶 | (20ml×30 倍) × 1 瓶 | 2-8℃保存 |
需要而未提供的試劑和器材
1. 37℃恒溫箱。
2. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
3. 精密移液器及一次性吸頭
4. 蒸餾水,
5. 一次性試管
6. 吸水紙
注意事項(xiàng)
1. 從 2-8℃取出的試劑盒,在開(kāi)啟試劑盒之前要室溫平衡至少 30 分鐘。酶標(biāo)包 被板開(kāi)封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,以避免試驗(yàn)誤差
3. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書的操作進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
4. 為避免交叉污染,要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜。
5. 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
6. 底物 B 對(duì)光敏感,避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。
洗板方法
手工洗板方法:甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下 用力拍幾次;將稀釋后的洗滌液至少 0.35ml注入孔內(nèi),浸泡 1-2 分鐘。根據(jù)需 要,重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。
自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中
標(biāo)本要求
1.不能檢測(cè)含NaN3 的樣品,因 NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的 (HRP) 活性。
2.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí) 驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
操作程序
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋: (本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,用戶可按照下列圖表在小
試管中進(jìn)行稀釋。)
200 ng/L | 5 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 120 μ l 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 120 μ l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
100 ng/L | 4 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 120 μ l 的 5 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 120 μ l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
50 ng/L | 3 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 120 μ l 的 4 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 120 μ l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
25ng/L | 2 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 120 μ l 的 3 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 120 μ l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
12.5 ng/L | 1 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 120 μ l 的 2 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 120 μ l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
2. 根據(jù)代測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白 孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3. 加樣:1) 空白孔,空白對(duì)照孔不加樣品,生物素標(biāo)記的抗 IL-10 抗體,鏈 霉親和素-HRP,只加顯色劑 A&B 和終止液,其余各步操作相同;2) 標(biāo)準(zhǔn)品 孔:加入標(biāo)準(zhǔn)品 50ul,鏈霉親和素-HRP50ul(標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素 抗體,故不加);3) 代測(cè)樣品孔:加入樣本 40ul,然后各加入抗 IL-10 抗體 10ul、鏈霉親和素-HRP50ul,蓋上封板膜,輕輕震蕩混勻,37℃溫育 60 分 鐘。
4. 配液:將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用。
5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置 30 秒后 棄去,如此重復(fù) 5 次,拍干。
6. 顯色:每孔先加入顯色劑A50ul,再加入顯色劑 B50 μ l,輕輕震蕩混勻,37℃ 避光顯色 15 分鐘.
7. 終止:每孔加終止液 50 μ l,終止反應(yīng) (此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
8. 測(cè)定:以空白空調(diào)零,450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度 (OD 值) 。 測(cè)定應(yīng) 在加終止液后 10 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
9. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,再根據(jù) 樣品的OD 值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟 件來(lái)計(jì)算。
操作程序總結(jié):
1.準(zhǔn)備試劑,樣品和標(biāo)準(zhǔn)品
2.加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,生物素標(biāo)記的二抗和酶標(biāo)試劑,37℃反應(yīng)60分鐘
3.洗板5次,加入顯色液A、B,37℃顯色15分鐘
4.加入終止液
5.10分鐘內(nèi)讀OD值
6.計(jì)算
檢測(cè)范圍:6ng/L →200 ng/L。
保存:2-8℃。
有效期:6 個(gè)月(2-8℃)。