用 途:用于大鼠血清、血漿及相關液體樣本中一氧化氮(NO)測定。
工作原理:
本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)測定樣品中大鼠一氧化氮(NO)水平。向預先包被了大鼠一氧化氮(NO)單克隆抗體的酶標孔中加入大鼠一氧化氮(NO),溫育;溫育后,加入生物素標記的抗NO抗體。再與鏈霉親和素-HRP結合,形成免疫復合物,再經過溫育和洗滌,去除未結合的酶,然后加入底物A、B,產生藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中大鼠一氧化氮(NO)的濃度呈正相關。
試劑盒組成:
需要而未提供的試劑和器材
37℃恒溫箱。
標準規格酶標儀。
精密移液器及一次性吸頭
蒸餾水,
一次性試管
吸水紙
注意事項:
從2-8℃取出的試劑盒,在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。
各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差
嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
為避免交叉污染,要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。
不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。
洗板方法:
手工洗板方法:甩掉酶標板內的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內,浸泡1-2分鐘。根據需要,重復此過程數次。
自動洗板:如果有自動洗板機,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中
標本要求:
1.不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
2.標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融。
操作程序:
標準品的稀釋:(本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。)
根據代測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定,能使用復孔的盡量做復孔。
加樣:1)空白孔,空白對照孔不加樣品,生物素標記的抗NO抗體,鏈霉親和素-HRP,只加顯色劑A&B和終止液,其余各步操作相同;2)標準品孔:加入標準品50ul,鏈霉親和素-HRP50ul(標準品中已事先整合好生物素抗體,故不加);3)代測樣品孔:加入樣本40ul,然后各加入抗NO抗體10ul、鏈霉親和素-HRP50ul,蓋上封板膜,輕輕震蕩混勻,37℃溫育60分鐘。
配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。
顯色:每孔先加入顯色劑A50ul,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.
終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。
測定:以空白空調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后10分鐘以內進行。
根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程,再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟件來計算。
操作程序總結:
1.準備試劑,樣品和標準品
2.加入準備好的樣品和標準品,生物素標記的二抗和酶標試劑,37℃反應60分鐘
3.洗板5次,加入顯色液A、B,37℃顯色15分鐘
4.加入終止液
5.10分鐘內讀OD值
6.計算
試劑盒性能:
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.92以上。
2.批內與批間應分別小于9%和15%
檢測范圍:
檢測范圍:1μmol/L -40μmol/L
。
保存條件及有效期:
保存:2-8℃。
有效期:6個月(2-8℃)。