組織化學(xué):
1。石蠟切片染色程序:用二甲苯或其他清洗劑和分級酒精系列對組織切片進(jìn)行脫蠟和水化,在自來水中沖洗5分鐘。如果需要,檢索抗原使用抗原揭膜溶液(檸檬酸鹽為基礎(chǔ),Cat。不。H-3300或tris型,Cat。不。h - 3301)。1 b。冷凍切片染色程序:風(fēng)干切片。染色前立即用丙酮固定切片。將片傳輸?shù)骄彌_區(qū)。如果內(nèi)源性酶活性存在,用適當(dāng)?shù)姆椒缁睢?/span>
2. 如果需要,使用鏈親和素/生物素阻斷試劑盒(Cat)進(jìn)行鏈親和素/生物素阻斷。不。sp - 2002)。Avidin/Biotin阻斷試劑盒(Cat.;不。SP-2001)是一種含有末端甘露糖殘基的糖蛋白。不建議使用親和素/生物素阻斷試劑盒,特別是當(dāng)使用甘露糖特異性凝集素時(shí)。
3.用carbofree™阻斷溶液(Cat)孵育片段阻斷非特異性結(jié)合。不。SP-5040)在室溫下放置30分鐘。從切片上吸去多余的堵塞溶液。
4. 在PBS (10 mM磷酸鈉,150 mM NaCl, pH 7.4)中加入約2-20 μg/ml的生物素化凝集素,在室溫下孵育30分鐘。用TPBS (PBS + 0.05% Tween®20)清洗。
5. 準(zhǔn)備VECTASTAIN®Elite®ABC-HRP (Cat)。不。PK-6100)或VECTASTAIN®ABC-AP (Cat;不。根據(jù)試劑盒說明使用AK-5000)試劑。涂于切片上,室溫孵育30分鐘。用TPBS清洗。6. 為步驟5中使用的酶系統(tǒng)應(yīng)用適當(dāng)?shù)某恋淼孜铩?/span>對于過氧化物酶,impact®DAB (Cat。不。SK-4105);用于堿性磷酸酶,impact®Vector®Red (Cat;不。推薦使用SK-5105)。用自來水沖洗。7. 防污(可選),清潔和安裝。
ELISA:
1。將50-200 μl約3 μg/ml的糖蛋白溶液放入所需孔中,將目標(biāo)蛋白吸附到微滴板上。有些井可能不進(jìn)行處理,作為負(fù)控制。37℃孵育1小時(shí)。用TPBS (PBS + 0.05% Tween 20)洗滌孔3次。
2. 阻斷非特異性結(jié)合,在室溫下用無碳水化合物阻斷溶液將每個(gè)孔填滿30分鐘。用TPBS洗三次井。在下面的程序中,試劑的體積為100 cm2膜的開發(fā)進(jìn)行了優(yōu)化。體積可以按比例調(diào)整不同大小的印跡。
3.在PBS中加入50-200 μl約2-20 μg/ml的生物素化凝集素,室溫孵育30分鐘。用TPBS洗三次井。
4. 根據(jù)試劑盒說明制備veectastain Elite ABC-HRP或veectastain ABC-AP試劑。涂于孔中,室溫孵育30分鐘。用TPBS洗三次井。
5. 為步驟4中使用的酶系統(tǒng)應(yīng)用適當(dāng)?shù)姆浅恋淼孜铩?/span>對于過氧化物酶,TMB (Cat。不。推薦使用SK-4400)。6. 用分光光度法定量有色反應(yīng)產(chǎn)物。
Western Blot:
1。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行電泳并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上。
2. 室溫下,在無碳水化合物阻斷溶液中培養(yǎng)30分鐘,阻斷非特異性結(jié)合。使用足夠的體積來覆蓋薄膜。
3.在含有約2-20 μg/ml生物素化凝集素的PBS中室溫孵育膜30分鐘。用TPBS (PBS + 0.05% Tween 20)洗滌。
4. 根據(jù)試劑盒說明制備veectastain Elite ABC-HRP或veectastain ABC-AP試劑。室溫下將膜在試劑中孵育30分鐘。用TPBS清洗。
5. 為步驟4中使用的酶系統(tǒng)應(yīng)用適當(dāng)?shù)牡孜铩?/span>對于過氧化物酶,DuoLuX®化學(xué)發(fā)光和熒光底物(過氧化物酶,Cat。不。SK-6604)或impact®DAB (Cat。不。sk - 4105)建議;堿性磷酸酶,化學(xué)發(fā)光和熒光底物(堿性磷酸酶,Cat。不。SK-6605)或BCIP/NBT(堿性磷酸酶,Cat。不。SK-5400)。僅供研究使用。不適用于動(dòng)物或人類的治療或診斷用途。
負(fù)控制:負(fù)控制應(yīng)該在上述每種方法中并行運(yùn)行,以驗(yàn)證綁定結(jié)果。當(dāng)應(yīng)用凝集素時(shí),最合適的陰性對照之一是預(yù)先吸收凝集素與已知凝集素具有高親和力的特定糖的濃度。Vector Laboratories提供了一系列用于這一目的的糖。將凝集素在含有約200 - 500mm糖的溶液中稀釋到合適的工作濃度。該混合物在室溫下結(jié)合30至60分鐘。在吸收孵育之后,將混合物替換為未吸收的凝集素,并在相同條件下孵育。測試方法遵循后續(xù)檢測程序。在大多數(shù)情況下,絕大多數(shù)凝集素結(jié)合到組織切片(膜印跡等)將被消除。在這些條件下,一些與切片的痕量結(jié)合(印跡等)可能仍然存在,并且可能表明存在二級或三級糖偏好。這些陰性對照結(jié)果應(yīng)與試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較,以確定結(jié)合的特異性。